NK-92细胞特性
NK-92细胞生长特性为悬浮生长,收到细胞后先观察瓶身是否完整,无漏液现象,培养基是否澄清透亮,在显微镜下观察细胞;
用75%的酒精擦拭瓶身后将细胞培养瓶先竖立静置2~4个小时,让细胞沉降到底部;细胞静置完后,将瓶中上面部分培养基小心吸出,留底部细胞和3ml左右培养基在原瓶;
吸出的细胞培养基离心收集细胞沉淀,离心转速1000转3分钟,或根据您的离心机实际情况而定,NK-92细胞对离心敏感,转速不宜过高;用2~3mlNK-92完培将得到的细胞沉淀重悬后,放回原瓶继续培养过夜,一个T25培养体积是5~6毫升;
NK-92细胞可按照200U/ml的浓度补加IL-2。
培养瓶为不透气瓶盖,一定要拧松到不掉的程度,使细胞充分透气;培养瓶横放,瓶口拧松透气,培养过夜;
显微镜下观察细胞,视细胞密度和培养基消耗情况,进行传代。不建议直接进行离心操作,因为经过运输颠簸和各种处理,细胞很可能达不到最佳状态。尽量不要吹散细胞团,加完液轻晃培养瓶即可。
细胞培养注意事项
NK-92细胞为悬浮生长,大部分细胞聚集成团,少数细胞分散,并且细胞间隙会有较多的死细胞和细胞碎片,且培养过程中经常能观察黑色的颗粒和小黑点,这些黑点大概是细胞带的,一般少量黑点不增殖不会影响细胞的生长,若黑点繁殖生长则怀疑细胞污染,会影响细胞生长,甚至使细胞死亡。
NK-92细胞对IL-2敏感。培养基中IL-2降解,将导致细胞状态变差。IL-2长期保存温度为-20℃,解冻后置于4℃冰箱保存,4℃保存不应超过两周。配制好的新鲜培养基要尽快用完,使用前预热,使用完毕后放回4℃冰箱保存;
NK-92细胞对离心敏感。正常培养时,换液周期为2~3天,建议交替使用半量换液和离心换液法,即半量换液2~3次后,离心全量换液一次。尽量减少离心次数,细胞状态不佳或细胞量少的时候,一般不建议离心。
细胞团块是否需要吹散?
团块需要吹散,但不用刻意吹散成单颗;
正常传代或者离心换液后吹打,控制吹打次数以及力度,即使细胞都分散成单个,也会在1~2天内聚集起来;细胞团太大时,需要分散;
细胞冻存的时候,细胞需要尽量分散,否则影响冻存效果。
换液方法
(1) 补液法:每2~3天补加适量(根据培养容器和原来细胞悬液体积来定,T25瓶一次补液1~2毫升即可)新鲜培养基,同时补加200U/mlIL-2,补加2-3次之后,离心全部换液。
(2) 半换液法:以T25瓶子(瓶中装有5ml培养基)为例,竖起瓶子静置一段时间(竖瓶前轻拍培瓶,让轻贴底部的细胞团浮起来),待细胞沉底(肉眼观察细胞沉底情况),小心吸出2.5ml上清转移到离心管,1000rpm 3~5min离心,离心后的细沉淀用2.5ml新鲜培养重悬后放回原瓶继续培养。细胞生长时,聚集的细胞团会逐渐增大,正常的细胞团在显微镜下呈现白色透亮状。若细胞聚集太多,出现细胞团中部发暗时,可进行传代。
传代方法
将细胞团用移液器轻轻吹散(一般吹2-3次即可,吹打力度不可过大,否则会出现大量死细胞和细胞碎片),均分到两个瓶子里,每瓶再补充等量完全培养基。细胞对营养要求很高,细胞量过多时会影响细胞生长;细胞团块过大时,需要稍微吹散,注意控制吹打次数,不需要全部吹散。
细胞冻存
推荐使用90%FBS+10%DMSO的冻存液配比,NK-92细胞可适量补加IL-2;尽量吹散细胞,注意控制吹打力度。
细胞复苏
复苏后,用6ml新鲜完全培养基,重悬细胞;离心后去除上清用1~2mL完全培养基重悬细胞,注意要少次轻柔吹打。
瓶子竖着放进培养箱,以增加细胞局部密度,瓶盖保持透气;
细胞生长需要稳定的环境,可每天观察1次,不要频繁拿出培养箱观察